摘要

TP53在腫瘤抑制中起關(guān)鍵作用，50%的侵襲性腫瘤顯示TP53基因突變。在本研究中，我們描述了具有TP53缺失的結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116 p53−/−），TP53缺失是來源于HCT116-p53+/+細(xì)胞的一個亞系。進(jìn)行RNA測序和網(wǎng)絡(luò)分析以確定新的耐藥機(jī)制。用多色熒光原位雜交（mFISH）和陣列比較基因組雜交（aCGH）鑒定染色體畸變。許多基因在HCT116 p53−/−細(xì)胞中過度表達(dá)：RND3/RhoE（235.6倍上調(diào)）、DCLK1（60.2倍上調(diào)）、LBH（31.9倍上調(diào)）、MYB（28.9倍上調(diào)）、TACSTD2（110.1倍下調(diào)），根據(jù)先前發(fā)表的研究，NRIP1（81.5倍下調(diào)）和HLA-DMB（69.7倍下調(diào)）是已鑒定的對多藥耐藥（MDR）有潛在影響的基因，它們與癌癥進(jìn)展和腫瘤發(fā)生有關(guān)�？赡苁怯捎�TP53缺失，DNA修復(fù)和凋亡的紊亂導(dǎo)致了細(xì)胞和機(jī)體組織的異常，最終增加了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展?jié)摿Α?/span>NFκB、PI3K和HSP70是融合蛋白網(wǎng)絡(luò)的中心，TH1-2通路是受影響的通路之一，可以推測炎癥通路與細(xì)胞周期調(diào)控和熱休克反應(yīng)共同參與耐藥表型。HCT116-p53−細(xì)胞比HCT116-p53+/+細(xì)胞有更多的染色體畸變、拷貝數(shù)的增加和減少。綜上所述，許多基因組畸變可能與未知的耐藥機(jī)制有關(guān)。這可能對未來的治療策略有重要的影響。

簡介

TP53被描述為基因組的守護(hù)者。當(dāng)外來和致癌物質(zhì)造成有害損害時，p53保持細(xì)胞完整性。DNA的畸變和損傷被p53識別，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和DNA修復(fù)。當(dāng)持續(xù)性損傷超過細(xì)胞修復(fù)能力極限時，p53可觸發(fā)細(xì)胞凋亡。p53誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制包括FAS、KILLER/DR5和線粒體途徑的轉(zhuǎn)錄激活。此外，細(xì)胞存活，如BCL2，IGFR、MCL-1、survivin和PIK3CA被p53抑制。P53在翻譯后修飾（如磷酸化、乙�；�和甲基化）激活后，除了凋亡和生長停滯外，還參與各種下游過程。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)和/或凋亡相關(guān)途徑維持基因組完整性。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，p53激活p21/waf1，p21/waf1是G2/M特異性細(xì)胞分裂控制蛋白2激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性G1激酶的抑制劑，隨后導(dǎo)致G2/M和G1檢查點控制。由于突變的p53而不能在G1和G2/M檢查點阻止細(xì)胞可導(dǎo)致耐藥性。

  DNA修復(fù)和凋亡機(jī)制對于維持人體細(xì)胞的健康狀態(tài)至關(guān)重要。在正常情況下，過度DNA損傷或其他畸變的細(xì)胞通過凋亡被消除。如果p53啟動的這種調(diào)控機(jī)制被破壞，就會出現(xiàn)異常的細(xì)胞增殖和過度的DNA損傷。p53基因突變是DNA修復(fù)和凋亡中斷的主要原因之一，而DNA修復(fù)和凋亡可能是由于異常細(xì)胞數(shù)量的增加而引發(fā)的，異常細(xì)胞更容易發(fā)生突變和染色體不穩(wěn)定。由于無功能的p53而導(dǎo)致DNA損傷累積的細(xì)胞的異常增殖也會影響具有額外突變的下一代細(xì)胞。最終，這會增加致癌的風(fēng)險。

超過50%的人類癌癥發(fā)生P53突變，而結(jié)直腸癌是經(jīng)常發(fā)生有害P53突變的癌癥類型之一。大多數(shù)突變發(fā)生在DNA結(jié)合域，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊或破壞DNA結(jié)合能力。凋亡功能的喪失是放射和耐藥癌細(xì)胞發(fā)展的一個重要原因。此外，具有p53突變的腫瘤通常具有加重轉(zhuǎn)移和基因組不穩(wěn)定性的特征。突變型p53的其他致癌功能包括促進(jìn)侵襲、遷移、血管生成和增殖，從而導(dǎo)致耐藥性增強(qiáng)和有絲分裂缺陷。上述功能只是突變型p53調(diào)控癌癥進(jìn)展的眾多途徑中的一小部分。例如，p53還通過限制糖酵解和促進(jìn)線粒體呼吸對藥物代謝和細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響。

在介導(dǎo)多藥耐藥（MDR）表型的ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白中，對多種藥物的耐藥性已經(jīng)得到了廣泛的研究。然而，多重耐藥性并不局限于ABC轉(zhuǎn)運體，其他多藥耐藥現(xiàn)象也已被描述，包括p53、Bcl-2、腫瘤增殖率等。先前對HCT116細(xì)胞系進(jìn)行了微陣列分析，但是基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法在同基因敲除細(xì)胞中的應(yīng)用使得細(xì)胞系之間能夠進(jìn)行更好和更深入的比較，以確定新的耐藥機(jī)制。

在這項研究中，我們應(yīng)用RNA測序，陣列比較基因組雜交（aCGH）和多色熒光原位雜交（mFISH）分析HCT116p53+/+結(jié)腸癌細(xì)胞及其p53缺失的耐藥亞系HCT116 p53−/−來表征基因，通路，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和染色體畸變與HCT116 p53−/−細(xì)胞系的耐藥性有關(guān)�？偟膩碚f，這項研究將提供一個完整的復(fù)雜的機(jī)制和遺傳改變結(jié)腸癌細(xì)胞及其貢獻(xiàn)的耐藥發(fā)生在p53缺失的概述。

材料與方法

  細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116 p53+/+及其耐藥HCT116 p53−/−亞系。HCT116 p53−/−細(xì)胞具有顯著的有絲分裂檢查點缺陷，因此它們不能正常對DNA損傷劑作出反應(yīng)，進(jìn)入有絲分裂，隨后在DNA損傷的情況下復(fù)制其基因組。在過去的幾年中，已經(jīng)研究了HCT116 p53−的耐藥譜。與野生型細(xì)胞相比，這些敲除細(xì)胞對已建立的多種藥理類別的抗癌藥物（阿霉素、5-氟尿嘧啶和5′-脫氧-5-氟尿嘧啶、順鉑和奧沙利鉑、足葉乙甙、，以及研究具有抗癌活性的細(xì)胞毒性化合物（三氧化二砷作為PML/RARA抑制劑，nutlin-3a作為p53激活劑，氟嘧啶F10，HDAC抑制劑entinostat和合成多胺DENSpm）和甚至細(xì)胞毒性但非癌癥藥物（抗瘧藥奎那克林，抗驚厥藥）丙戊酸鈉與布洛芬的抗炎及COX1/2抑制作用

RNA測序

基因表達(dá)采用FPKM（每千堿基轉(zhuǎn)錄物每百萬映射讀取片段數(shù)）測量進(jìn)行量化（Choudhri et al.2018；Wesolowski et al.2013）。HCT116 p53−/−細(xì)胞中基因的解除調(diào)控是通過將HCT116 p53−/−細(xì)胞中基因的總FPKM值除以HCT116p53+/+細(xì)胞中的FPKM值來計算的。

路徑與網(wǎng)絡(luò)分析

應(yīng)用±7的RNA表達(dá)的倍數(shù)變化進(jìn)行過濾，然后對解除調(diào)控的基因列表進(jìn)行Ingenuity Pathway Analysis（IPA）（QIAGENRedwood City，USA，www.qiage.comn、 com/Ingenuity）識別HCT116 p53−細(xì)胞中的特定網(wǎng)絡(luò)和通路。

熒光分析系統(tǒng)

HCT116 p53−/−和HCT116 p53+/+細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)制備以獲得中期擴(kuò)散，并使用分子細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)行分析。如先前報道的，使用人類全染色體涂料作為探針進(jìn)行mFISH。

基因體檢查

使用QIAmp DNA迷你試劑盒,從HCT116p53−/−和HCT116 p53+/+細(xì)胞中提取全基因組DNA。aCGH按照之前的報告進(jìn)行。

蛋白質(zhì)印跡

在HCT116 p53−/−和HCT116 p53+/+細(xì)胞中評估所選基因（即ANGPT2和過氧化氫酶）的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，以驗證通過RNA測序分析發(fā)現(xiàn)的調(diào)控解除。用蛋白提取緩沖液（M-PER）從細(xì)胞中提取總蛋白™ 哺乳動物蛋白提取試劑與1%Halt混合™ 蛋白酶抑制劑雞尾酒。將相當(dāng)于30μg的樣品加載到10%SDS-PAGE中進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到Ruti®-PVDF膜中。用5%BSA封閉膜1小時，并在4°C下用選定的抗ANGPT2、過氧化氫酶和β-肌動蛋白的一級抗體進(jìn)行探測（1:1000）。24h后，用HRP二級抗體（1:2000）孵育1h，用Luminata檢測™ Classico Western HRP基板。圖像分析采用ImageJ軟件。

結(jié)果

HCT116 p53−細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜、下游途徑和網(wǎng)絡(luò)分析

與HCT116 p53+/+細(xì)胞相比，HCT116 p53-細(xì)胞中每個基因表達(dá)的RNA-seq衍生FPKM值的比率被認(rèn)為是基因表達(dá)的倍數(shù)變化。為了進(jìn)一步分析，考慮了閾值為±7的差異基因表達(dá)，得出了300個差異表達(dá)基因。表1列出了HCT116-p53-細(xì)胞中前10個上調(diào)和下調(diào)基因。RND3（+235.6）、MCPH1（+85.7）和MYB（+28.9）是上調(diào)最多的基因，而DPEP1（−431.9）、ICAM1（−166.5）和NPM2（−85.4）是下調(diào)最多的基因。

表1與HCT116 p53 +/+細(xì)胞相比，HCT 116 p53/+細(xì)胞中前10個上調(diào)和下調(diào)基因

在網(wǎng)絡(luò)1中，組蛋白H4、細(xì)胞周期蛋白A和NFκB的節(jié)點數(shù)最多，CD3和Hsp70的節(jié)點數(shù)最多。網(wǎng)絡(luò)1中的“癌癥”、“組織損傷和異常”，而網(wǎng)絡(luò)2中的“細(xì)胞組裝和組織”和“分子運輸”是受影響的生物學(xué)功能。Erk1/2在網(wǎng)絡(luò)3中的節(jié)點數(shù)最高。“機(jī)體損傷和異常”和“碳水化合物代謝”是網(wǎng)絡(luò)3中受影響的生物功能（圖1）。

圖1與HCT116p53 +/+細(xì)胞相比，HCT 116 p53/-細(xì)胞中受影響的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。用綠色標(biāo)記的基因被下調(diào)，用紅色標(biāo)記的基因被上調(diào)。

一些已知參與耐藥的基因被解除調(diào)控，這意味著HCT116 p53−細(xì)胞表現(xiàn)出多因子耐藥表型。如果應(yīng)用±7.0的倍數(shù)變化閾值，則一個DNA修復(fù)基因、一個氧化應(yīng)激基因和一個轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)儆诮獬�調(diào)控的耐藥基因，這意味著這些基因類別的基因可能對HCT116 p53−的MDR表型有重要影響。這些基因如表2所示，所有參與抗性機(jī)制的解除調(diào)控基因的完整列表如補(bǔ)充表2所示。

表2與野生型HCT116 p53 +/+細(xì)胞相比，HCT 116 p53/+細(xì)胞中參與經(jīng)典耐藥機(jī)制的去調(diào)節(jié)基因(閾值:表達(dá)改變7倍)

對前三大網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了合并，并對合并后的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了進(jìn)一步分析。（圖2）所示，NFκB與PI3K和HSP70一起位于融合網(wǎng)絡(luò)的中心。

圖2網(wǎng)絡(luò)1、2和3的合并蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)

“癌癥”、“機(jī)體損傷和異常”以及“細(xì)胞間信號和相互作用”是HCT116p53−細(xì)胞中受影響最大的生物學(xué)功能（圖3）。位于前10個生物功能列表中的基因如補(bǔ)充表3所示。

圖3與HCT116 p53 +/+細(xì)胞相比，HCT116 p53 +/細(xì)胞中受影響的生物學(xué)功能(前10)。橙色線表示統(tǒng)計顯著性閾值(p = 0.05)

“Th1通路”（p值：0.000437）、“IL4信號通路”（p值：0.012589）是HCT116 p53−細(xì)胞中最重要的信號通路之一，這意味著可能的免疫應(yīng)答通路對耐藥性產(chǎn)生影響（圖4）。

圖4與HCT116 p53 +/+細(xì)胞相比，HCT116 p53 +/細(xì)胞中受影響的信號通路(前10)。橙色線描繪了統(tǒng)計顯著性閾值(p = 0.05)，橙色圖描繪了每個途徑中去調(diào)控基因的比例

在116個p53靶基因中（Fischer 2017），33個下調(diào)，19個上調(diào)（倍數(shù)變化高于±1.5的閾值），如表3所示。

表3與HCT116-p53 +/+細(xì)胞相比，HCT 116 p53/-細(xì)胞中p53靶基因的去調(diào)節(jié)

在蛋白質(zhì)水平上對所選基因進(jìn)行ANGPT2和過氧化氫酶的驗證。如圖5所示，在HCT116 p53−細(xì)胞中，ANGPT2上調(diào)（+8.7倍），而過氧化氫酶下調(diào)（−1.9倍），與RNA測序輸出相關(guān)，并在蛋白質(zhì)水平驗證RNA表達(dá)數(shù)據(jù)。

圖5通過蛋白質(zhì)印跡法測定的血管生成素樣蛋白2和過氧化氫酶在HCT116 p53和HCT116p53 +/+細(xì)胞中的表達(dá)

mFISH

HCT116-p53 +/+細(xì)胞顯示核型45 < 2n >，X，dup(10)(q？q？)，der(16)t(8；16)(p13；？)，der(18)t(17；18) (?q；p11.2)，而HCT 116-p53/-細(xì)胞具有45 < 2n > X，t(5；7)(q1？3;p22)，dup(10)(q？q？)，der(16)t(8；16)(p13；？)，der(18)t(17；18)(?q；p11.2)。圖6中描述了微熒光分析的結(jié)果。HCT116-p53細(xì)胞具有克隆性從頭平衡易位t(5；7)(q1？3;p22)與HCT116-p53 +/+細(xì)胞相比。

圖6：HCT116 p53+/+（a）和HCT116p53−/—（b）細(xì)胞的mFISH分析

aCGH

HCT116 p53 +/+:染色體擴(kuò)增和缺失在RNA Seq分析中觀察到的基因表達(dá)的去調(diào)控中得到很好的反映。LVRN下調(diào)3.3倍，AP3S1上調(diào)1.7倍。相應(yīng)的染色體基因座(5q23.1)被擴(kuò)增。FLJ42393下調(diào)了1.7倍。在相應(yīng)的染色體位點(3q 27.3–q28)有一個缺失。結(jié)果總結(jié)在表4中。HCT116 p53/:與HCT116 p53 +/+細(xì)胞相比，在HCT 116-p53/+細(xì)胞中觀察到更多的擴(kuò)增和缺失。這意味著p53缺失導(dǎo)致額外的染色體畸變、擴(kuò)增和缺失的積累。NXPH2上調(diào)了1.7倍，并且在相應(yīng)的染色體座位上有擴(kuò)增。OR5K2上調(diào)了1.7倍，在相應(yīng)的染色體座位上有擴(kuò)增。PARK2下調(diào)了8.1倍，在相應(yīng)的染色體位點上有一個缺失。aCGH數(shù)據(jù)與RNA-Seq結(jié)果的相關(guān)性清楚地顯示了基因在相應(yīng)染色體基因座擴(kuò)增/缺失的差異表達(dá)，如表4所示。表5描述了總體aCGH結(jié)果。

表4染色體畸變和相應(yīng)的去調(diào)控基因。aCGH和核糖核酸測序圖譜的比較

表5：aCGH總體結(jié)果

討論

在本研究中以結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 p53+/+和具有TP53缺失的耐藥HCT116p53-亞系為模型，旨在鑒定新的耐藥基因。通過RNA測序、mFISH和aCGH鑒定基因表達(dá)譜、信號通路、生物學(xué)功能和染色體異常，一些已知參與耐藥的基因被解除調(diào)控，支持HCT116 p53−細(xì)胞的多因子耐藥表型，這些基因在各種耐藥簇中被鑒定，包括凋亡、DNA修復(fù)、鐵下垂、谷胱甘肽相關(guān)、熱休克、氧化應(yīng)激，補(bǔ)充表2中列出的轉(zhuǎn)錄因子可能對MDR表型有重要影響。

最上調(diào)的基因RND3/RhoE（+235.6倍）以前與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，并被報道為腫瘤耐藥的潛在標(biāo)志物胃癌以及結(jié)直腸癌病例的復(fù)發(fā)和預(yù)后。CARD11突變與伊布替尼有關(guān)。CARD11（−7.4倍）出現(xiàn)在前五大生物學(xué)功能的基因列表中，表明細(xì)胞凋亡抑制下調(diào)CARD11可能在HCT116p53−細(xì)胞的耐藥表型中起重要作用。據(jù)報道，CARD11對癌癥中的伊布替尼耐藥有貢獻(xiàn)，即CARD11可能在HCT116p53−/−細(xì)胞的耐藥表型中發(fā)揮作用。據(jù)報道，DCLK1（+60.2倍）與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥相關(guān)，miR539靶向DCLK1導(dǎo)致對順鉑的敏感性增加。DCLK1也與結(jié)直腸癌、胰腺癌和腎癌的耐藥性相關(guān)。據(jù)報道，LBH（+31.9倍）是肝細(xì)胞癌的潛在標(biāo)志物，因為其過度表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。Myb（+28.9倍表達(dá)于敲除細(xì)胞）是一種致癌轉(zhuǎn)錄因子，在促進(jìn)白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。Myb與結(jié)腸癌細(xì)胞的順鉑耐藥性有關(guān)。它還參與一些實體瘤的發(fā)展和進(jìn)展，包括黑色素瘤TACSTD2的缺失通過抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)鱗癌的進(jìn)展和耐藥性，這意味著TACSTD2可以作為鱗狀細(xì)胞癌病理分級的標(biāo)志物（圖1表2與野生型HCT116 p53+/+細(xì)胞相比，HCT116 p53-細(xì)胞中參與經(jīng)典耐藥機(jī)制的解除調(diào)控基因（閾值：±7倍變化表達(dá)）差異表達(dá)（倍變化）DNA修復(fù)XRCC211.200 BRIP1 7.711氧化應(yīng)激NCF215.131 MB−8.093轉(zhuǎn)錄因子MYB 28.855 NFATC4−7.619 。在HCT116 p53−/−細(xì)胞中下調(diào)110.1倍，指出TACSTD2下調(diào)可能是導(dǎo)致HCT116 p53−/−細(xì)胞侵襲性生長和多藥耐藥的機(jī)制。NRIP1下調(diào)后，食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。本文觀察到NRIP1在HCT116p53−細(xì)胞中下調(diào)81.5倍，這意味著NRIP1下調(diào)可能在多藥耐藥表型中發(fā)揮作用。HLA-DMB（−69.7倍）屬于主要的組織相容性復(fù)合體II類基因，晚期漿液性卵巢癌中，HLA-DMB的高表達(dá)通過增加CD8淋巴細(xì)胞數(shù)量與較高的生存率相關(guān)。HLADMB的下調(diào)可能通過影響腫瘤侵襲性與HCT116 p53−細(xì)胞的MDR表型有關(guān)。 

MYB轉(zhuǎn)錄因子的過度表達(dá)（+28.8倍于敲除細(xì)胞的表達(dá)）與不良預(yù)后相關(guān)，并且經(jīng)常在結(jié)直腸癌（CRC）中觀察到。另一項研究指出，MYB在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)由于其致瘤作用而調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，這有可能影響CRC患者免疫治療的使用。MYC（+5.1倍）是另一種在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。它調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，并且在各種癌癥類型中觀察到過表達(dá)，包括結(jié)腸癌。

本實驗已經(jīng)在HCT116 p53−細(xì)胞中確定了最受影響的信號通路中的IL4信號通路，這意味著免疫應(yīng)答通路可能影響耐藥性。一項研究表明，IL-4可增強(qiáng)BCR信號傳導(dǎo)，降低BCR激酶抑制劑（如伊布替尼）在CLL細(xì)胞中的有效性。另一項研究報告，通過白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1和4（IRAK1/4）復(fù)合物激活先天免疫途徑有助于FLT3突變AML細(xì)胞的適應(yīng)性抵抗。這一結(jié)果支持我們觀察到的免疫應(yīng)答途徑與耐藥性的關(guān)系。

RNA-seq結(jié)果通過westernblotting對ANGPT2和過氧化氫酶進(jìn)行驗證。與HCT116 p53-+/+細(xì)胞相比，在HCT116 p53-/-細(xì)胞中，angpt2mrna上調(diào)，而CAT mRNA下調(diào)。蛋白表達(dá)證實了這一點。CAT在腫瘤中經(jīng)常下調(diào)，例如，乳腺癌的特點是過氧化氫酶下調(diào)并伴隨SOD過度表達(dá)。另一方面，ANGPT2的上調(diào)與結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)分析指出，網(wǎng)絡(luò)1的“癌癥”、“機(jī)體損傷與異常”、“細(xì)胞組裝與組織”、“分子運輸”網(wǎng)絡(luò)2的“機(jī)體損傷與異常”、“碳水化合物代謝”網(wǎng)絡(luò)3為主要影響因素功能。由于TP53缺失，DNA修復(fù)和凋亡機(jī)制的破壞可能導(dǎo)致細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的異常，最終增加了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展?jié)摿�。在網(wǎng)絡(luò)1中，編碼組蛋白H4、細(xì)胞周期蛋白A和NFκB的基因具有最高的結(jié)點數(shù)。CD3和HSP70在網(wǎng)絡(luò)2的中心有最多的節(jié)點，這意味著細(xì)胞周期調(diào)控的影響炎癥和熱休克反應(yīng)對耐藥性的影響。重要的是，網(wǎng)絡(luò)2中分子轉(zhuǎn)運基因的出現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了p53和細(xì)胞轉(zhuǎn)運蛋白之間可能存在的相互作用，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的MDR。ABC轉(zhuǎn)運蛋白的一個成員ABCB1/MDR1基因在轉(zhuǎn)錄上依賴于p53，其中野生型p53通過序列特異性結(jié)合下游啟動子對ABCB1/MDR1基因表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響。相反，突變型p53在不同細(xì)胞系中激活ABCB1/MDR1啟動子。ERK1/2基因在網(wǎng)絡(luò)3中具有最高的節(jié)點數(shù)，表明ERK調(diào)控的細(xì)胞增殖途徑對耐藥性的貢獻(xiàn)。    

NFκB與PI3K和HSP70一起位于融合網(wǎng)絡(luò)的中心，這意味著炎癥途徑以及細(xì)胞周期和熱休克反應(yīng)在MDR表型中的作用。Th1、Th2通路和CD28信號通路是HCT116-p53-細(xì)胞中最受影響的信號通路之一，支持炎癥通路在MDR表型中起重要作用的假說。

結(jié)論

總的來說，通過RNA測序、mFISH和aCGH分析結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 p53和HCT116p53 +/+的基因表達(dá)譜，以比較的方式鑒定差異表達(dá)的基因、受影響的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)、途徑、生物學(xué)功能以及染色體畸變。發(fā)現(xiàn)了多種基因、途徑和網(wǎng)絡(luò)，它們可能與結(jié)腸癌的耐藥性和侵襲性行為有關(guān)。這項研究清楚地表明，TP53敲除細(xì)胞的耐藥性是由多個因素決定的，而不是由單個因素決定的。顯然，多因素耐藥性使新治療策略的開發(fā)變得復(fù)雜。然而本研究可能代表了一個設(shè)計更具體和更有前途的繞過耐藥性的抗癌策略的起點。